肿瘤细胞迁徙是恶性肿瘤最沉要的特点之一
，瘤细胞由其原发部位侵入血管或淋巴管或体腔
，部门细胞被血液、淋巴液带到另一部位或器官
，在该处滋天生长
，形成与原发瘤同样类型的肿瘤
，这一过程即为肿瘤的侵袭和转移。

    目前检测肿瘤细胞迁徙的步骤重要有细胞划痕尝试及Trans-Well幼室迁徙尝试
，传统的细胞划痕尝试必要陆续观测以评估药物对细胞迁徙的作用
，因而
，其面对的最大的问题是不能保障每次观察的都是统一位点
，对了局不能进行定量分析
，也不能分辨划痕内的细胞是迁徙还是增殖的而来的。而Trans-Well幼室迁徙尝试虽能定量检测细胞迁徙的数量
，但不能直观观测细胞迁徙过程
，也不能将迁徙和增殖细胞分辨出来
，并且其价值昂贵
，不适合抗肿瘤细胞迁徙药物的大规模筛选。

细胞迁徙尝试介绍

细胞迁徙与侵袭尝试将Transwell幼室放入造就板中
，幼室内称上室
，造就板内称下室
，高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔
，将钻研的细胞种在上室内
，由于聚碳酸酯膜有通透性
，基层造就液中的成分能够影响到上室内的细胞
，利用分歧孔径和经过分歧处置的聚碳酸酯膜
，就能够进行共造就、细胞趋化、细胞迁徙、细胞侵袭等多种方面的钻研。

    Transwell幼室放入造就板中
，幼室内称上室
，造就板内称下室
，上室内盛装上层造就液
，下室内盛装基层造就液
，高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内
，由于聚碳酸酯膜有通透性
，基层造就液中的成分能够影响到上室内的细胞
，从而能够钻研基层造就液中的成分对细胞成长、活动等的影响。利用分歧孔径和经过分歧处置的聚碳酸酯膜
，就能够进行共造就、细胞趋化、细胞迁徙、细胞侵袭等多种方面的钻研。

Transwell孔径的选择

※共造就尝试：在选择膜孔径的时辰必要思考尝试的主张和尝试细胞的大幼
，当膜孔径幼于3μm的时辰
，细胞不会迁徙通过
，所以若是不涉及钻研细胞活动能力
，应选择3μm以下的
，通常是0.4μm或者3μm
，例如在共造就系统钻研细胞B排泄或代谢产品对细胞A的影响
，就能够把A种在上室里
，将B种鄙人室。
※趋化性尝试：可用5.0、8.0、12.0?m膜
，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室
，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
i.细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室
，细胞B种于下室
，能够钻研细胞B排泄或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
ii.趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室
，下室参与某种趋化因子
，可钻研该趋化因子对细胞的趋化作用。

肿瘤细胞迁徙尝试（transwell migration）

常用8.0μm（8μm孔径的膜为文件中用来做侵袭和转移尝试最常用的规格
，本次订购的是Corning公司的用来做transwell migration的8μm孔径的24孔板transwell insert以及用来做transwell invasion的BD公司的8μm的24孔板铺胶transwell chamber）、12.0?m膜
，上室种肿瘤细胞
，下室参与FBS或某些特定的趋化因子
，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑
，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁徙能力。FBS是最常用的趋化因子
，本尝试也筹备选用FBS作为迁徙和侵袭尝试的趋化因子。

肿瘤细胞侵袭尝试（transwell invasion）

    常用8.0、12.0?m膜
，道理与肿瘤细胞迁徙尝试类似
，上室种肿瘤细胞
，下室参与FBS或某些特定的趋化因子
，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑
，但与肿瘤细胞迁徙尝试分歧的是
，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶
，用以仿照体内细胞表基质
，细胞欲进入下室
，先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解
，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

细胞迁徙尝试步骤

1、Transwell 幼室的造备

    ※Corning公司的8μm孔径无胶24孔板transwell insert

               i. 预平衡：在24孔板中和transwell幼室中参与造就液
，在37℃的造就箱里平衡一个幼时或者过夜
，这样可能加强细胞的粘附作用。

               ii. 正式使用：24孔板中参与含5-10%FBS的造就液0.6ml
，将transwell inset 放入板中（用镊子）
，在transwell insert中参与无血清的培液0.1ml。（操作手册提醒：尝试过程中
，培液的高度必要按时的去观察
，当必要维持要求高度的时辰能够补加新鲜培液） 

    ※BD公司的8μm孔径铺有基层胶的24孔板transwell chamber

               i.再水化：从-20℃中取出并打开包装置于室温
，往transwell幼室以及24孔板中各参与37℃的培液0.5ml
，而后置于37℃
，5%CO₂造就箱中孵育2h使得基质胶再水化。

               ii.再水化后：幼心的将培液吸走
，把稳别触到基质胶。

2、造备细胞悬液

            i. 造备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h
，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

            ii. 消化细胞
，终止消化后离心弃去造就液
，用PBS洗1－2遍
，用含BSA的无血清造就基沉悬。调整细胞密度至1－5×10⁵个/ml
，具体的细胞密度需进行预尝试
，migration与invasion的细胞密度也有所分歧（细胞量过多
，穿过膜的细胞会过多过快
，若是最后用计数法统计了局的话将难以计数；而过少的话
，可能还没到检测的功夫点
，所有的细胞都已穿过
，因而至少也要保障在收样的时辰
，上室内还要有肯定量的细胞存在。）

3、接种细胞

          i. 取细胞悬液体积V1参与Transwell幼室
，分歧规格Transwell幼室对细胞悬液量有分歧要求
，参考说明书。Corning公司24孔板transwell insert中参与的体积为0.1ml
，BD公司的铺胶24孔板transwell insert中参与的体积为0.5ml。

          ii.24孔板下室通常参与体积V2含FBS的造就基（FBS浓度需进行预尝试）
，分歧的造就板加的量有分歧要求
，具体请参考说明书。出格把稳：基层造就液和幼室间；嵊衅莶
，一旦产生气泡
，基层造就液的趋化作用就减弱甚至隐没了
，在种板的时辰要出格留心
，一旦呈显禅泡
，要将幼室提起
，去除气泡
，再将幼室放进造就板。

          iii. 通例造就12－48h
，功夫点的选择需思考到细胞侵袭能力、趋化成分和细胞数量等。

          iv.  当苦衷项

       l  必要思考转oligo之后与NC相比
，会不会对细胞的增值以及凋亡产生影响
，若是转oligo后能抑造细胞增值以及推进细胞凋亡的话
，那必要关注MDA-231侵袭能力的降落是由于细胞数主张削减还是由于的确转移和侵袭能力下调了（是否必要加一个什么都不转的对照组?）

    l  功夫过长不成以
，同样
，过短也不能
，由于细胞内会有肯定量的MMPs贮存
，短功夫内可能侵袭能力不会有太大扭转。同时从oligo的转入到进而阐扬作用
，影响MMPs表白
，到最后开释到造就基中
，还必要一个过程
，所以功夫太短效应不显著
，但是功夫的耽搁不能影响到细胞增值的扭转。

    l  细胞在幼室内的状态有可能不是正常造就贴壁的状态
，而是圆形的
，仍是悬浮时的状态
，不外会荟萃成团
，属正常景象（别人的经验
，把稳观察）

    l  在造就过程中
，膜下会逐步有少量幼气泡产生
，这是正常景象
，可不予处置
，但若是出现了大气泡
，肯定要去除
，不然严沉影响尝试了局。最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看
，确信没有大气泡产生。

4、了局统计

    ※去除基层胶和未侵袭出胶的细胞（参照BD公司的操作手册）

          i.  去除transwell幼室中的造就液

          ii. 用干净的湿棉签
，柔和地但是均一使劲擦除幼室膜上表表的基质胶以及未侵袭出胶的细胞（invasion）
，或者擦除未转移跨膜的细胞（migration）。

          iii.  用第二根湿棉签沉复一次

把稳：整个过程应该尽量快的实现
，以免膜下表表的细胞干掉。

    ※细胞固定与染色

          i. 结晶紫染色法：先固定后染色
，各文件中固定步骤不一
，大体有以下几种:100%甲醇固定10min、4%的多聚甲醛固定15min或者100%乙醇固定10min。固定完之后用0.1%的结晶紫染色染30min。该步骤为文件中最常用的步骤（订购结晶紫试剂）

          ii. 瑞氏染色法：同样是先固定
，能够选用100%甲醇固定10min
，随后用瑞氏染液即A液一倍体积混合B液2倍体积后染色相应功夫。该染色步骤文件中使用较少
，所以染色功夫有待摸索
，凭据幼赵师兄之前的经验应该在20分钟以上。

          iii. 使用BD公司的Diff-Quik staining kit：这个步骤文件中也有使用
，操作步骤严格依照BD公司的使用手册
，但是须采办BD公司kit
，较贵。

    ※ 细胞计数

         i.用敏感的刀片将膜从幼室中分离下来
，具体是先将刀尖插入膜与幼室的边缘处形成一个幼口
，而后让幼室逆着刀口的方向旋转
，这样膜就被分脱离来
，当剩下一些衔接的时辰用镊子以尽量少的接触面积夹在膜上
，最终将渣滓的膜分离。

         ii.事先筹备好一块载玻片
，在上面滴一滴油
，将宰割下来的膜有细胞面朝上用镊子置于油上
，随后再在膜上滴加一滴油
，盖好盖玻片后
，置于显微镜下拍照计数。

注：细胞计数能够用显微拍照装置拍下几个拥有代表性的视野而后进行计数
，也能够直接在显微镜下计数
，前者较优。

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